Variación genética del PRRSV
Por: Laura Batista, Michael Murtaugh y Carlos Pijoan
La infección por el virus del Sín-drome Reproductivo y Respi- ratorio Porcino (PRRS) constituye uno de los mayores problemas en la Industria Porcina . La diferencia en los signos clínicos y la aparente emergencia de nuevos síndromes se deben en parte a los cambios en el genoma del PRRSV. La variación biológica ocurre como consecuencia natural de la replicación viral, ésta permite que el virus se adapte a los cambios medio ambientales y además nos permite reconstruir los patrones de cambio viral en el campo.
La identificación precisa de los aislamientos del PRRSV mediante la determinación de la secuencia de nucleótidos del material genético es una herramienta muy valiosa para entender el éxito o fracaso en la detección del PRRS, su control y/o erradicación, posibles fuentes de introducción a rebaños libres y de dispersión por área, además de diferenciar entre los virus de campo y vacunales.
Las características biológicas y patológicas del PRRSV (v.g. la forma en que crece, como causa enfermedades, como desencadena la respuesta inmune, como persiste, etc.) están determinadas por las proteínas virales. Estas proteínas son cadenas de aminoácidos de los cuales existen 20 diferentes tipos. Cada tipo tiene una estructura química distinta, las cadenas formadas por varios tipos y número de aminoácidos resultan en una proteína con propiedades especiales tanto biológicas como funcionales. La cadena de letras indica el orden exacto de los aminoácidos, el tipo específico de aminoácido en cada posición y el número total de aminoácidos en la proteína. Esta es la secuencia de la proteína y cada proteína tiene su propia secuencia. El material genético también es una secuencia de cuatro bloques llamados bases de las que existen 4 tipos A, C, G y T.
En el caso del virus del PRRS el material genético está definido por aproximadamente15.000 de estas cuatro bases. Los aminoácidos de las proteínas están codificados por una minicadena de tres bases. El punto clave sobre la información de la secuencia es que es una cadena de bases o de aminoácidos codificados que determina las propiedades biológicas.
Las secuencias, ya sean de nucleótidos o de aminoácidos, de los aislamientos del PRRSV de diferentes granjas raramente son idénticos. La variación ocurre ya sea porque las bases pueden cambiar durante la replicación viral, un proceso llamado mutación, o porque el material genético se recombina y produce nuevos virus por la mezcla de dos virus preexistentes. Los cambios en la secuencia de los nucleótidos pueden dar una modificación en la secuencia de aminoácidos y por lo tanto producir un virus con diferentes propiedades. Estas variaciones son la máquina biológica que permite que el virus se adapte y persista ante los cambios del medio ambiente.
De cualquier manera, la nueva forma esta relacionada con la forma ancestral de la que se derivó y a la que es casi idéntica. Las relaciones entre los aislamientos de PRRSV pueden deducirse al comparar las secuencias entre sí. Los cambios son acumulativos, mientras que aislamientos muy relacionados son casi idénticos, los aislamientos distantes tienen las mismas diferencias que los aislamientos tempranos y además cambios adicionales que los hacen únicos.
En teoría, los cambios en la secuencia del PRRSV también pueden llevar a cambios biológicos o de patología. Sin embargo, hasta la fecha la relación entre la variación en la secuencia de nucleótidos o aminoácidos y el comportamiento del PRRSV no se conoce. Por lo tanto, no es posible asociar las características genéticas del PRRSV con sus propiedades biológicas o características generales.
Secuenciación diagnóstica del PRRSV
Para obtener información sobre la secuencia, el material genético del PRRSV en muestras de sangre, fluidos o tejidos se envían al laboratorio de diagnóstico donde el material es purificado. El material se somete a varios procedimientos bioquímicos y la secuencia exacta de nucleótidos se determina en una máquina de secuenciación de DNA.
En este caso se pueden hacer muchos análisis pero la experiencia nos ha dictado que con la información de un solo gen, o sea aproximadamente del 5% del genoma, nos dará suficientes características genéticas del aislamiento de forma rápida y económica.
La región que generalmente se secuencía es la ORF5 (open reading frame) que tiene 600 pares de bases y que codifica una proteína de 200 aminoácidos conocida como la glicoproteína de la cápsula. Esta proteína es de mucho interés pues es la que adhiere el virus a los macrófagos para iniciar el ciclo de infección, también porque es un blanco importante para los anticuerpos neutralizantes y también porque tiene regiones que son muy variables.
El ORF 7 que codifica la proteína de la nucleocápside del PRRSV también se utiliza para análisis genéticos. Tiene 372 bases y codifica a una proteína con 123 aminoácidos. Este gen es mucho más conservado que el ORF 5 y en algunos casos puede sugerir que los aislamientos son iguales mientras que la secuencia del ORF 5 sugiera lo contrario. La Figura 2 muestra la representación esquemática del genoma del PRRSV y su organización.
Una vez que se ha obtenido la secuencia esta puede ser analizada directamente o convertida a la secuencia de aminoácidos. La información importante se obtiene al comparar la secuencia obtenida con una base de datos donde se tienen secuencias de cepas vacunales, aislamientos previos y otras secuencias relevantes.
Un problema al que nos enfrentamos es que actualmente los métodos de obtención, análisis y reporte de la información no se han estandarizado. La región exacta del genoma, el número de bases secuenciadas, el uso de secuencias de nucleótidos o aminoácidos y los programas computarizados varían entre laboratorios. Aunque la información sea de alta calidad, es difícil comparar entre laboratorios.
Interpretación y uso de las secuencias
La Figura 2, nos muestra un ejemplo de una alineación de varias secuencias. Los puntos representan los aminoácidos que no han cambiado y las letras los que sí han cambiado. De aquí podemos obtener información de la secuencia exacta de cada aislamiento. Desafortunadamente hasta la fecha no se sabe de ninguna base o aminoácido que sea responsable por ninguna característica específica del PRRSV. También podemos obtener la similitud entre diferentes aislamientos. Esta similitud es sólo la relación entre las bases idénticas con las bases comparadas (600 bases o 200 aminoácidos para el caso del ORF5). Collins sugiere como guía general que una diferencia de 10 o menos bases se interpreta como una relación directa de un total de 960 bases . Sin embargo, hasta hoy no es posible establecer valores estrictos que marquen la diferencia entre cepas relacionadas e independientes.
La secuenciación es método muy poderoso para monitorear los aislamientos del PRRSV en el tiempo dentro de un rebaño. Puede detectar y diferenciar aislamientos múltiples y ofrecer información sobre los efectos de las diferentes prácticas de manejo en poblaciones positivas a PRRSV como puede ser el reto homólogo a las hembras primerizas durante la aclimatación. Nos puede ayudar también para determinar la fuente de infección o la re-emergencia de cepas preexistentes. Para la interpretación es importante tomar en cuenta la historia de vacunación y el manejo del rebaño. También debemos recordar que un solo animal puede mantener 2 cepas, evento poco frecuente, si lo comparamos con la frecuencia de encontrar diferentes cepas en la misma granja, ya sea en un área o diferentes áreas de la granja.
Interpretación de dendogramas
Los programas de computación comparan todos los posibles pares de secuencias, agrupando los más similares y nuevamente comparándolos con el resto de las secuencias. Este proceso se repite hasta que se construye un árbol, el dendograma. Este proceso asume que las diferencias entre las secuencias son al azar y que son mutaciones independientes durante el proceso de evolución del virus. Existen diferentes formas de presentar los dendogramas. El filograma presenta los resultados en forma de una árbol de 90 grados.
La segunda forma es el dendograma radial. La diferencia entre el filograma y el radial es que en el radial no sugiere una cepa específica ancestral mientras que en el filograma el árbol parte de una cepa primordial que ha dado origen al resto de las cepas analizadas. La Figura 4 muestra los dos tipos de dendogramas.
Lo que las secuencias no dicen
La información contenida en el genoma del PRRSV define las características biológicas del virus. La variación genética define la expresión de diferentes características como son los signos clínicos, la severidad de los mismos, el crecimiento en cultivos celulares, la respuesta inmunológica, etc. Sin embargo la relación entre la secuencia y las características del virus del PRRS NO se conocen. Por lo tanto, hasta la fecha no es correcto utilizar la información de las secuencias para definir la virulencia o para seleccionar una vacuna.
El uso de las secuencias para comparar y contrastar diferentes aislamientos es útil en la evaluación de brotes PRRS. Puede diferenciar entre virus residentes y nuevas introducciones a la granja, así como las cepas vacunales de las cepas de campo. Es muy efectivo para monitorear a nivel de piara las nuevas introducciones y los cambios en el tiempo. Es importante recordar que la interpretación y uso de la información de secuencias depende de datos de alta calidad. Finalmente la información de secuenciación no puede ser utilizada para hacer inferencias sobre las propiedades biológicas del PRRSV y es mucho más útil cuando se usan tanto las alineaciones y los dendogramas.
